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一、项目实施目的、意义

目的：

1.研究TMAO 对THP-1 巨噬细胞极化作用。

2.研究白介素37（IL-37）对巨噬细胞M1,M2极性分化在钙化性主动脉瓣疾病炎症反应中的调节作用及机制。

3.研究IL-37是否可以调控TMAO 对THP-1 巨噬细胞极化作用及机制。

4.进一步系统培养本科生团队的课外学术科研能力，通过项目从开题到结题完整周期的团队协作，培养本科生的Team-Work精神和严谨的科研素质，为更深一步的研究生学习奠定基础。

意义：

1.随着社会人口老龄化日趋加速和人们预期寿命的延长，心血管疾病对人民的威胁日益严峻，而钙化性主动脉瓣疾病患病率呈逐年上升趋势，目前已发展为仅次于冠心病和高血压病的第三大心血管疾病，严重危害着老年人的健康。其发病机制尚未明了，临床上缺乏防治该病的药物。导师课题组之前期研究表明炎症反应参与了该病的发生发展。鸡蛋、肝脏、乳制品、花生等富含胆碱、磷脂酰胆碱和肉碱的膳食成分可代谢为三甲胺(TMA)，随后被宿主肝黄素单加氧酶(FMOs)转化为三甲胺n -氧化物(TMAO)15。本项目研究TMAO预处理THP-1细胞并对巨噬细胞极化的影响，防止钙化性主动脉瓣疾病的进展，为通过控制胆碱饮食治疗钙化性主动脉病提供了线索。

2.M1、M2巨噬细胞是近年来肿瘤及免疫研究的热点之一，但在心血管疾病研究领域如钙化性主动脉瓣疾病方面研究尚未见报道。巨噬细胞具有高度可塑性、炎症因子诱导下分化异常等特点。在不同环境的刺激下巨噬细胞可极化为经典活化巨噬细胞（M1型巨噬细胞）和替代性活化巨噬细胞（M2型巨噬细胞），两者极化功能几乎相互拮抗。该项目将研究白介素37（IL-37）对巨噬细胞M1,M2极性分化的调节作用，及其在钙化性主动脉瓣疾病炎症反应中的作用及机制。该项目将填补M1,M2巨噬细胞极性分化在钙化性主动脉瓣疾病中的作用以及IL-37对巨噬细胞极性分化的调节作用的研究空白，为防治钙化性主动脉瓣疾病提供新的理论支持。

3.该项目探讨IL-37是否可以调控TMAO 对THP-1 巨噬细胞极化作用，这一方面丰富了有关钙化性主动脉瓣疾病的理论，另一方面为防治钙化性主动脉瓣疾病进展提供了新思路与新靶点。

4.该项目探讨IL-37以及TMAO对于巨噬细胞表观遗传修饰的影响，从基因的层面诠释巨噬细胞M1,M2极性分化背后的原因。

二、项目研究内容和拟解决关键问题

研究内容:

第一部分：研究TMAO 对THP-1 巨噬细胞极化作用。

1.1 细胞实验：

1）先用LPS处理THP-1巨噬细胞；

2）用TMAO处理THP-1巨噬细胞；

3）用TMAO预处理THP-1巨噬细胞，然后用LPS处理THP-1细胞；

1.2 上述三步实验均检测巨噬细胞的极化状态及炎症指标：

①用免疫染色以及流式细胞仪检测其极化状态

②收集培养液，用ELISA方法测培养液中IL-6、IL-8、MCP-1的浓度；

③收集细胞总蛋白，用免疫印迹方法测ICAM-1等炎症指标表达量。

2.第二部分：研究白介素37（IL-37）对巨噬细胞M1,M2极性分化的调节作用及其在钙化性主动脉瓣疾病炎症反应中的作用

2.1对比主动脉瓣钙化组织病人与非钙化对照组的组织中M1，M2型巨噬细胞的表达。通过CD68抗体，CD11c抗体免疫染色M1巨噬细胞；CD68，CD206免疫染色M2巨噬细胞；

2.2细胞实验：

1）先用LPS和IFN-γ处理THP-1巨噬细胞；

2）用IL-37、IL-4处理THP-1巨噬细胞；

3）用IL-37预处理THP-1巨噬细胞，然后用LPS和IFN-γ处理THP-1细胞；

上述三步实验均检测巨噬细胞的极化状态及炎症指标：

①用免疫染色以及流式细胞仪检测其极化状态

②收集培养液，用ELISA方法测培养液中IL-6、IL-8、MCP-1的浓度；

③收集细胞总蛋白，用免疫印迹方法测ICAM-1等炎症指标表达量。

第三部分：研究IL-37在调控TMAO介导的M1巨噬细胞极化中发挥的作用及其机制

细胞实验：

3.1用免疫染色，免疫印迹以及RT-PCR方法对比来自主动脉瓣钙化病人与非钙化对照组的组织和细胞的IL-37水平；

3.2用IL-37蛋白多肽预处理THP-1巨噬细胞，再用TMAO处理细胞；

3.3用小干扰RNA（siRNA）沉默IL-37表达，再用TMAO处理细胞；

3.4用质粒过表达IL-37，再用TMAO处理细胞；

上述三步实验均比较处理组和对照组炎症指标的情况，观测指标：

1）用免疫染色以及流式细胞仪检测其极化状态

2）收集培养液，用ELISA方法测培养液中IL-6、IL-8、MCP-1的浓度；

3）收集细胞总蛋白，用免疫印迹方法测ICAM-1等炎症指标表达量。

4）收集细胞DNA,用chip-qpcr检测细胞表观遗传修饰

动物实验：

4.1 检测正常小鼠和Nlrp3基因敲除小鼠血清TMAO浓度。

4.2 对正常小鼠和Nlrp3基因敲除小鼠分别进行：对照饮食+注射生理盐水，高胆碱饮食+生理盐水，对照饮食+IL-37治疗，高胆碱饮食+IL-37治疗。

4.3 用组织染色、免疫荧光染色、Elisa法等再测定正常小鼠和Nlrp3基因敲除小鼠血清TMAO浓度、主动脉瓣纤维化情况、主动脉瓣组织M1和M2细胞浸润情况及Nlrp3表达量。

拟解决关键问题:

1．验证TMAO能够诱导THP-1细胞向M1巨噬细胞极化。相关文献提示TMAO诱导小鼠骨髓源性巨噬细胞(BMDMs）向M1巨噬细胞极化，然而TMAO能否诱导THP-1细胞向M1巨噬细胞极化以及能否在钙化性主动脉瓣疾病细胞模型发挥保护作用都是关键问题，决定着本项目是否可行，预实验数据的支持增加了本项目的可行性。

2．验证白介素37（IL-37）对巨噬细胞M1,M2极性分化的调节作用及其在钙化性主动脉瓣疾病炎症反应中的作用。前期研究提示IL-37与M1极化呈负相关，在本项目中我们需要对此进行验证性实验，以支持后续实验的可行性和准确性。

3．本项目关注研究IL-37在调控TMAO介导的M1巨噬细胞极化中发挥的作用及其机制。文献提示TMAO对M1巨噬细胞极化起正性作用，IL-37起负性作用；IL-37和TMAO均分别通过影响NLRP3炎症小体进而影响M1巨噬细胞极化。在TMAO和IL-37两种因素共存时，他们对M1巨噬细胞极化的作用如何？它们在巨噬细胞中的作用方式是否像以前研究报道的通过影响NLRP3炎症小体发挥作用？这些问题均与研究内容密切相关，也是本项目重点关注的关键问题。

4．目前文献提示IL-37通过被caspase-1切割活化后进入细胞核内参与转录调控，而TMAO会使巨噬细胞表现出一种高度激活的状态。而TMAO造成的这种状态可能是TMAO影响了巨噬细胞的表观遗传修饰导致的。TMAO和IL-37是否是通过影响细胞的表观遗传修饰来发挥作用？

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